میکروسکوپی الکترونی روبشی (SEM)

میکروسکوپ الکترونی روبشی(Scanning Electron Microscopy)، نوعی میکروسکوپ الکترونی است که قابلیت عکس‌برداری از سطوح با بزرگنمایی ۱۰ تا ۵۰۰۰۰۰ برابر با قدرت تفکیکی کمتر از ۱ تا ۲۰ نانومتر (بسته به نوع نمونه) دارد. SEM یک وسیله شناخته شده برای تعیین مشخصات فیزیکی و بررسی مورفولوژی سطح نمونه با بزرگ‌نمایی بالا است که در آن از پرتو الکترونی استفاده می‌شود. با تولید یک باریکه الکترونی و تاباندن آن به سطح نمونه و ثبت پرتوهای بازگشتی در میکروسکوپ الکترونی روبشی، می ­توان اطلاعات مختلفی از لایه ​های سطحی ماده به دست آورد. این اطلاعات بسته به آشکارسازهای متصل به دستگاه در رده​های متفاوتی قابل استفاده است.

فهرست مطالب

میکروسکوپ الکترونی روبشی(Scanning Electron Microscopy)، نوعی میکروسکوپ الکترونی است که قابلیت عکس‌برداری از سطوح با بزرگنمایی ۱۰ تا ۵۰۰۰۰۰ برابر با قدرت تفکیکی کمتر از ۱ تا ۲۰ نانومتر (بسته به نوع نمونه) دارد. SEM یک وسیله شناخته شده برای تعیین مشخصات فیزیکی و بررسی مورفولوژی سطح نمونه با بزرگ‌نمایی بالا است که در آن از پرتو الکترونی استفاده می‌شود. با تولید یک باریکه الکترونی و تاباندن آن به سطح نمونه و ثبت پرتوهای بازگشتی در میکروسکوپ الکترونی روبشی، می ­توان اطلاعات مختلفی از لایه ​های سطحی ماده به دست آورد. این اطلاعات بسته به آشکارسازهای متصل به دستگاه در رده​های متفاوتی قابل استفاده است.

میکروسکوپ الکترونی روبشی همچنین می ­تواند با پرتو ایکس پراکنده شده انرژی (EDX) همراه شود تا ترکیب نمونه به‌ خوبی دیگر خواص آن (آنالیز عنصری نمونه) اندازه‌گیری شود. میکروسکوپ الکترونی روبشی برای تحقیق در مورد تشخیص ابعاد ذرات، یکنواختی پوشش سطح و عیب­های سطحی نیز مورد استفاده قرار می‌گیرد. سطح نمونه​ هایی که با این میکروسکوپ بررسی می​شوند باید دارای هدایت الکتریکی باشند و در غیر این صورت، الکترونی که به سطح نمونه تابیده می​شود، دفع نمی​شود و روی سطح باقی می ​ماند و  الکترون​های بعدی با الکترون​های همنام برخورد می​ کنند و دفع یا منحرف می​ شوند و در نتیجه تصویر حاصله، ناپایدار و منجر به تیره و روشن شدن تصویر می​ شود. با نشاندن لایه نازکی از طلا و یا کربن روی سطوح نمونه​ های غیرهادی، هدایت الکترونی پیدا می​ کنند و الکترون​های سطحی دفع شده و وضوح تصاویر بهبود می‌یابد.

چنانچه به ​دست آوردن تصاویری با بزرگنمایی بیشتر از حد معمول مورد نظر باشد، از میکروسکوپ الکترونی روبشی نشر میدانی (FESEMاستفاده می‌شود. FESEM نوعی میکروسکوپ الکترونی روبشی است که کاتد نشر میدانی تفنگ الکترونی آن، پرتوهای باریک​تری که حاوی الکترون​های با انرژی بیشتری هستند را تولید می​ کنند. در این نوع میکروسکوپ، تصاویر شفاف​تر و با کیفیت بالاتر تولید می​ شوند و مشاهده ناحیه بسیار کوچک​تر امکان‌پذیر می​ شود. تفنگ الکترونی، لنزها، روزنه‌ها، سیستم روبش، محفظه نمونه، سیستم خلاء و سیستم نمایش از اجزای اصلی یک SEM  محسوب می‌شوند.

تفنگ الکترونی

تفنگ الکترونی منبع پایداری از الکترون است که پرتو الکترونی را ساطع می‌کند. تفنگ‌های الکترونی را از لحاظ مکانیسم به دو دسته تقسیم می‌کنند:

  • تفنگ‌های الکترونی ترمویونی
  • تفنگ‌های الکترونی انتشار میدانی

تفنگهای الکترونی ترمویونی

هر چند این تفنگ‌ها انواع مختلفی دارند اما اصول کار آن‌ها یکی است، لذا در اینجا به بررسی تفنگ‌ها رشته تنگستنی می‌پردازیم که عملاً ساده‌تر هستند. در این تفنگ‌‌ها، کاتد تولیدکننده الکترون، یک سیم تنگستنی است که وسط آن به شکل  Vخم شده و شعاع سر آن حدود ۱۰۰ میکرومتر است. در این تفنگ‌ها سر فیلمان تنگستن بر اثر عبور جریان تا ۲۷۰۰ درجه کلوین گرم شده و طبق قانون ریچاردسون- داچمن جریانی تاA/cm2  ۱٫۷۵ منتشر می‌کند. علت استفاده از تنگستن در این تفنگ‌ها، تابع کار پایین و مقاومت بالای آن در برابر حرارت و جریان الکتریسیته است. میزان دمای فیلمان تأثیر مستقیمی روی میزان الکترون‌های خارج شده از یک سو و عمر آن از سوی دیگر دارد. الکترون‌های تولید شده در فیلمان (کاتد) با استفاده از اختلاف پتانسیلی معادل ۱٫۰۰۰ تا ۵۰٫۰۰۰ ولت به سمت آند شتاب گرفته و با سرعت به سمت آن می‌روند و بخشی از آن‌ها از سوراخ میانی آند عبور کرده با سرعت به سمت ستون اپتیکی میکروسکوپ و در نهایت نمونه فرستاده می‌شوند. شایان ذکر است که در این تفنگ‌ها علاوه بر کاتد و آند، یک درپوش نیز قرار دارد که دارای سوراخ بوده و نسبت به کاتد در بایاس منفی قرار دارد تا با یک میدان الکترواستاتیک به متمرکز شدن الکترون‌ها کمک کند.

آنچه در مورد تفنگ‌های الکترونی اهمیت دارد، تأثیر جریان فیلمان بر روشنایی تصویر است، به‌طور نمونه با افزایش دمای فیلمان از ۲۷۰۰ به ۳۰۰۰ درجه روشنایی حدود ۵ برابر افزایش می‌یابد اما عمر آن بین ۳۰ تا ۶۰ برابر کاهش می‌یابد که این موضوع ضرورت تنظیم دما را به خوبی نشان می‌دهد.

تفنگهای انتشار میدانی

این تفنگ‌ها از قدرت، دقت، هزینه بالاتر و ساخت به مراتب پیچیده‌تری برخوردارند. این تفنگ‌ها از یک تک‌بلور تنگستن با یک نوک بسیار تیز (۲/۰ میکرومتر) تشکیل شده که که به آن میدانی وارد می‌شود و این میدان سبب جدا شدن الکترون‌ها از بلور می‌شود. برای اینکه میدان در سر بلور بیشتر شود سر آن را خیلی تیز می‌کنند و این سر تیز سبب می‌شود قطر پرتو خروجی نیز کوچکتر شود؛ بنابراین در این تفنگ دو کاتد وجود دارد که اولی وظیفه جدا کردن الکترون‌ها و دومی ‌برای سرعت دادن به الکترون‌ها به کار گرفته می‌شود؛ و الکترون‌های خروجی از میان دو آند به سمت ستون اپتیک فرستاده می‌شوند. یکی از مزیت‌های پرتو تولیدی این تفنگ آن است که اختلاف انرژی الکترون‌ها کمتر بوده و در کل پرتو تولیدی از کیفیت بالاتری برخوردار است که در نتیجه به خطاهای کمتر و تصاویر بهتر و شفافتری منجر خواهد شد. این موارد در کنار عمر بالای این تفنگ‌ها سبب اقبال عمومی به آن‌ها شده‌است.

لنزها

بخشی از SEM که پرتو الکترونی را متمرکز، جابه‌جا و اصلاح می‌کند، به ستون اپتیکی معروف است و عملاً بخش‌های آن با اتفاقاتی که برای نور درمیکروسکوپ نوری می‌افتد مشابه‌سازی و نام‌گذاری شده ‌است که مهمترین بخش این ستون نیز لنزها هستند که با هدف متراکم کردن پرتو الکترونی استفاده می‌شوند. لنزهای نوری بر اساس شکست نور کار می‌کنند اما در لنزهای اشعه الکترونی، با اعمال نیرو به الکترون‌ها مسیر آن‌ها عوض می‌شود. ذرات الکترون بار منفی دارند لذا عملاً دو راه برای اعمال نیرو به آن‌ها وجود دارد که این دو راه استفاده از میدان‌های الکتریکی و مغناطیسی است. هرچند روابط حاکم بر میدان الکتریکی ساده‌تر است اما از آنجا که امکان ایجاد و کنترل میدان مغناطیسی قوی با هدف متمرکز کردن پرتو الکترونی ساده‌تر است معمولاً در SEM از لنزهای مغناطیسی استفاده می‌شود. ستون اپتیکی از تعدادی لنز متمرکزکننده و یک لنز نهایی تشکیل شده که در انتهای ستون و قبل از جسم قرار گرفته‌ است. اصول کار این لنزها تقریباً یکسان است با این تفاوت که لنز نهایی از قدرت بیشتر و شکلی متفاوت برخوردار است.

روزنه

روزنه‌ها سوراخهایی با ابعاد متفاوت هستند که در مکانهای گوناگون ستون اپتیکی قرار گرفته و علاوه بر کاهش قطر پرتو الکترونی سبب حذف الکترونهایی می‌شوند که از مرکز ستون فاصله دارند که این کار می‌تواند سبب افزایش کنتراست تصویر شود و خروجی بهتری را ایجاد کند. آنچه در مورد روزنه‌ها محدودکننده است یکی کاهش روشنایی تصویر و دیگری بحث پراش الکترونی است که در صورتی رخ می‌دهد که قطر روزنه در حد طول موج الکترون‌ها باشد و باعث از بین رفتن وضوح تصویر ‌شود. بنابراین در هنگام تنظیم و استفاده از روزنه‌ها همواره باید این موضوع را مد نظر قرار داد.

روبشگر

همانگونه که گفته شد برای ایجاد یک تصویر کامل باید پرتو الکترون با تک تک نقاط یک ناحیه از نمونه برخورد کند که ابعاد این ناحیه بر حسب بزرگنمایی تعیین می‌شود. پس از تعیین ناحیه، لازم است پرتو تغییر جهت داده و کل منطقه مشخص شده را در ردیف‌های موازی و به صورت نقطه به نقطه در دو راستای  X  و Y روبش کند و برای این کار از دو سیم‌پیچ با میدان‌های مغناطیسی استفاده می‌شود که با اعمال میدان‌هایی عمود بر مسیر پرتو و با مقدار کنترل شده سبب تغییر جهت پرتو الکترونی می‌شوند. به‌این ترتیب پرتو الکترون به صورت کنترل شده با نقطه مشخص برخورد می‌کند.

محفظه نمونه

همانگونه که در ادامه به آن خواهیم پرداخت، نمونه SEM در خلأ مورد بررسی قرار می‌گیرد همچنین از برخورد پرتو الکترونهای پرسرعت با نمونه، اشعه Xحاصل می‌شود که برای کاربر بسیار زیان‌آور است، این عوامل سبب می‌شود نمونه درون محفظه‌ای قرار بگیرد که بسیار محکم بوده و دارای سرب است. این محفظه دارای مکانهایی برای قرارگیری نمونه است که در هر لحظه می‌توان چندین نمونه را بر روی آن قرار داد و از بیرون مشخص کرد که کدامیک مورد بررسی قرار بگیرد یا نمونه را برای بررسی بالا و پایین برد یا زاویه دار کرد. همچنین در این محفظه مکانهایی برای قرارگیری حسگرها قرارداده شده و اتصالاتی نیز قرار دارد که امکان برقراری ارتباط ایمن از داخل محفظه به بیرون را فراهم می‌آورد بدون اینکه خلأ دچار مشکل شود یا اینکه اشعه X به کاربر آسیب برساند. روی این محفظه همچنین سوراخهایی قرار دارد که با در پوشهایی پوشانده شده و در صورتی که قرار باشد قطعه‌ای به SEM  اضافه شود از آن‌ها استفاده خواهد شد.

سیستم خلأ

میکروسکوپ‌های الکترونی تحت خلأ کار می‌کنند که دلایل زیادی برای آن وجود دارد. مهمترین این دلایل را می‌توان دست یافتن به پرتو متمرکزتر و عمر بیشتر دستگاه دانست. مسافت طی شده بدون برخورد توسط الکترون در فشار یک اتمسفر ۱ سانتمتر است در حالی که در فشارTorr   ۱۰-۶ این مسافت برابر ۶ متر خواهد بود. Torr واحد قدیمی‌فشار هوا است که در سیتمهای خلأ میکروسکوپ‌های الکترونی کاربرد دارد و هر Torr برابر ۱۳۳ پاسکال است. همچنین در صورت وجود هوا امکان تخلیه الکتریکی نیز وجود دارد. علاوه بر این امکان سوختن، از بین رفتن و ایجاد واکنش روی نمونه و فیلمان تفنگ الکترونی نیز وجود دارد که تمام این موارد به لزوم ایجاد خلأ بالا در دستگاه اشاره دارد. برای ایجاد خلأ در این دستگاه روش‌های متنوعی وجود دارد که به صورت تکی یا ترکیبی بنا به مدل دستگاه استفاده می‌شوند.

سیستم نمایش

سیستم نمایش در واقع یک سیستم جانبی در کنار SEM است که برای نمایش دادن تصاویر حاصل از آن به کار گرفته می‌شود. در واقع این سیستم همان مونیتور است که خروجی بدست آمده از هر نقطه از نمونه را با شدت روشنایی معادل‌سازی و به کاربر نشان می‌دهد. به ‌این ترتیب می‌توان تصویری با رنگ خاکستری ایجاد نمود که نشانگر خواص ماده خواهد بود. بر حسب میزان بزرگنمایی و سطح مورد بررسی بر روی نمونه و دقت قدرت تفکیک میکروسکوپ از یک سو و اندازه و قدرت تفکیک صفحه نمایش از سوی دیگر رابطه‌ای بین نقاط جسم و صفحه نمایش برقرار خواهد شد. در گذشته این کار به صورت آنالوگ و بر روی صفحات CRT انجام می‌شد که امروزه با پیشرفت تکنولوژی دیجیتال و رایانه‌ها و صفحات کریستال مایع پیشرفت زیادی در کنترل و رابط‌ های کاربری صورت گرفته ‌است.

یکی از محدودیتهای میکروسکوپ الکترونی عبوری علاوه بر ضخامت بسیار کم نمونه، این است که الکترونها به جای عبور، بازتاب و یا جذب می‌شوند که باعث کاهش کیفیت تصاویر میشود. این محدودیت موجب ایجاد انگیزه برای توسعه میکروسکوپ‌های الکترونی که قابلیت بررسی نمونه‌های ضخیمتر را داشته باشند، شد. به بیان دیگر نیاز به دستگاهی با پرتو الکترونی که همانند میکروسکوپ نوری با قدرت تفکیک فضایی بالاتر کار کند، وجود دارد.

ویژگی‌های میکروسکوپ الکترونی روبشی

محدوده بزرگنمایی این نوع از میکروسکوپ الکترونی بین ۱۰ تا ۵۰۰٫۰۰۰ برابر است. این در حالی است که قدرت تفکیک آن در حد ۳ تا ۱۰۰ نانومتر است. البته کیفیت تصویر  تخت در بزرگنمایی کمتر از ۴۰۰-۳۰۰ برابر، به خوبی میکروسکوپ نوری نیست. هر جامد یا مایعی که فشار بخار کم دارد (کمتر از ۳-۱۰تور) می‌تواند با استفاده از این میکروسکوپ بررسی شود. محدودیت اندازه نمونه به طراحی دستگاه مربوط می‌شود. از محدودیت‌های این دستگاه، این است که سطح مورد بررسی باید رسانا باشد. بنابراین نمونه‌های عایق با لایه نازکی از ماده رسانا مانند طلا، باید پوشانده شوند. بررسی جنس نقاط مختلف سطح و توزیع خواص سطحی از قابلیت‌های این دستگاه است و نیاز به خلاء موجب زمانبر شدن تهیه تصویر می‌شود.

ساختار و اصول کاری میکروسکوپ الکترونی روبشی

در میکروسکوپ الکترونی روبشی نیز پرتو الکترون‌ها باعث تشکیل تصویر می‌شوند، بنابراین تفنگ الکترونی از اجزای اصلی این میکروسکوپ می‌باشد. پرتو الکترونی مورد نیاز برای این میکروسکوپ بین ۱ تا ۳۰ کیلو الکترون ولت در خلاء شتاب داده می‌شود و به کل نقاط سطح برخورد می‌کند، مانند آنچه در صفحه تلویزیون روی می‌دهد. در اینجا نیز مانند میکروسکوپ‌های الکترونی عبوری، عدسی‌های مختلفی مانند عدسی‌های متمرکزکننده، عدسی‌های شیئی و چشمی وجود دارد. عدسی‌های متمرکزکننده باعث می‌شوند قطر پرتو تا حدود ۲ تا ۱۰ نانومتر کاهش پیدا کند. سیستم خلاء نیز در اینجا مشابه میکروسکوپ الکترونی عبوری است. اما روش تشکیل تصویر و نحوه بزرگنمایی کاملاً متفاوت است. شکل  زیر ساختار کلی میکروسکوپ الکترونی روبشی را نشان می‌دهد که مجهز به آشکارسازهای الکترون ثانویه و برگشتی هستند.

دیگر تجهیزات آزمایشگاهی

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

کروماتوگرافی روشی برای تشخیص اجزاء در ابعاد نانومتری با دقتی در حد و اندازه مولکولی است. اساس کار کروماتوگرافی جداسازی مخلوط‌ها بر پایه توزیع اجزاء آن بین دو فاز ساکن و متحرک می‌باشد.
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) مهم‌ترین و متداول‌ترین روش کروماتوگرافی است که به علت حساسیت بالا، تعیین مقدار کمی با صحت بالا، قابلیت آنالیز نمونه‌های غیرفرار و حساس به دما، بیشترین رشد و کارایی را نسبت به دیگر روش‌های جداسازی داشته است. با استفاده از کروماتوگرافی با کارایی بالا می‌توان نمونه‌های متنوعی از مولکول‌های زیستی تا یون‌ها را مورد آزمایش قرار داد. تنوع استفاده از نمونه‌ها و دقت بالای این روش به آزمایشگاه‌ها این امکان را می‌دهد تا نمونه‌های مختلف را با صرف هزینه کمتر و دقت بالا، مورد آزمایش قرار دهند.

ادامه مطلب »

میکروسکوپ فلورسانس (MF)

تصویربرداری فلورسانس یک روش پرکاربرد در مطالعات سلولی است که به پایش فرآیندهای سلولی و عملکرد داروها در موجودات زنده کمک می کند. در میکروسکوپ فلورسانس از فلورسانت به جای پراکندگی، جذب یا بازتابش نور برای مطالعه خواص نمونه های زیستی یا غیر زیستی استفاده می شود. بررسی نمونه‌ها در این میکروسکوپ‌ با استفاده از نشاندار کردن بخش‌هایی از نمونه با رنگ‌های فلورسانس انجام می‌شود. به‌طور کلی از میکروسکوپ‌های فلورسانس برای تصویربرداری از اجزای ساختاری نمونه‌های کوچک مانند سلول، انجام مطالعات زیست‌پذیری در مورد جمعیت‌های سلولی، تصویربرداری از مواد ژنتیکی درون سلول DNA و RNA و مشاهده سلول‌های خاص در یک جمعیت بزرگ‌تر با روش‌هایی مانند FISH استفاده می شود.

ادامه مطلب »

کروماتوگرافی یونی (IC)

کروماتوگرافی تبادل یونی یاکروماتوگرافی یونی (IC) Ion chromatography، یک نوع کروماتوگرافی مایع است که برای جداسازی ترکیبات آلی و معدنی به کار میرود. به طور کلی کروماتوگرافی تبادل یونی از دو فاز متحرک و ساکن تشکیل شده است که هر دو قطبی هستند. فاز ساکن حاوی گروه‌های عاملی یونیزه شده باردار است که با یون‌های آنالیت بار مخالف تعامل دارند و در فرایند شویش، یون‌های محلول بافر شستشو جایگزین یون‌های آنالیت می‌شوند. شویش و جداسازی مولکول‌هایی که به فاز ساکن متصل هستند با تغییر pH بافر و افزایش غلظت یون‌های مخالف انجام می‌شود. این روش جداسازی بر اساس بار آنالیت به دو دسته کروماتوگرافی تبادل کاتیونی و کروماتوگرافی تبادل آنیونی تقسیم می‌شود.

به طور گسترده از کروماتوگرافی مبادله یونی برای شناسایی و آنالیز داروها، پروتئین‌ها، پادتن‌ها و نوکلئیک اسیدها استفاده می‌شود. به دلیل گستردگی کروماتوگرافی تبادل یونی، این عبارت گاهی به‌جای کروماتوگرافی یونی نیز استفاده می‌شود. با این حال کروماتوگرافی یونی عنوانی کلی است که شامل کروماتوگرافی تبادل یونی (IEX)، کروماتوگرافی حذف یون (IEC) و کروماتوگرافی جفت یونی (IP) می‌شود.

ادامه مطلب »