میکروسکوپ فلورسانس
تصویربرداری فلورسنت یا فلورسانس یک روش پرکاربرد در مطالعات سلولی است که به پایش فرآیندهای سلولی و عملکرد داروها در موجودات زنده کمک می کند. در میکروسکوپ فلورسانس از فلورسانت به جای پراکندگی، جذب یا بازتابش نور برای مطالعه خواص نمونه های زیستی یا غیر زیستی استفاده می شود. بررسی نمونه‌ها در این میکروسکوپ با استفاده از نشاندار کردن بخش‌هایی از نمونه با رنگ‌های فلورسانس انجام می‌شود.
میکروسکوپ فلورسانس با استفاده ازیک منبع نوری با شدت بالا (نور فرابنفش)، بخش‌های فلورسنت را در نمونه مورد نظر، تحریک کند. این بخش‌های فلورسنت، بازتابی با انرژی کمتر و طول موجی بلندتر از خود ساطع می‌کنند که در این حالت تصویری با بزرگنمایی مناسب از نمونه ایجاد می‌شود. هنگامی‌که نور پس زمینه منعکس شده در این نوع میکروسکوپ فیلتر می‌شود، قسمت‌های نشاندار شده از یک نمونه معین قابل تصویربرداری است. این ویژگی به محققان توانایی مشاهده قسمت‌های مورد نظر یا ویژگی‌های منحصر به فرد سطح نمونه مورد بررسی را می‌دهد. در این میکروسکوپ ها عموما از منبع های نور مرسوم همانند لامپ های جیوه ای و زنون استفاده می شود. با این حال در برخی میکروسکوپ ها از منابع پیچیده تر مانند LED ها و نور لیزر نیز استفاده می شود.
به‌طورکلی از میکروسکوپ‌های فلورسانس برای تصویربرداری از اجزای ساختاری نمونه‌های کوچک مانند سلول، انجام مطالعات زیست‌پذیری در مورد جمعیت‌های سلولی، تصویربرداری از مواد ژنتیکی درون سلول DNA وRNA و مشاهده سلول‌های خاص در یک جمعیت بزرگتر با روش‌هایی مانند FISH استفاده می شود.
کار با میکروسکوپ فلورسانس
اغلب، در ابتدا نمونه مورد بررسی با ماده فلورسنت یا فلوئوروفور نشاندار می‌شود. سپس از طریق عدسی با منبع نور با انرژی بالا، مورد تابش قرار می‌گیرد. این نور توسط فلوئوروفورها جذب شده و باعث می‌شود که آنها نور را با انرژی کمتر و طول موج بیشتر بازتاب کنند. این نور فلورسنت با استفاده از فلیترهایی که برای طول موج خاص طراحی شده‌اند، جدا می‌شوند و به بیننده اجازه می‌دهد تا تنها آنچه که دارای فلورسانس است را ببیند.
وظیفه اصلی میکروسکوپ فلورسانس این است که اجازه می‌دهد، پرتو نور بر نمونه مورد نظر بتابد و سپس نور بازتاب شده از نمونه با انرژی کمتر را جمع‌آوری کند. میکروسکوپ فیلتری دارد که فقط اجازه تابش پرتویی خاص با طول موج مشخصی که با ماده فلورسنت مورد استفاده، مطابقت دارد را می‌دهد. تابش این اشعه با اتم‌های درون نمونه برخورد کرده و الکترون‌های موجود در آن را برانگیخته می‌کند و به سطح انرژی بالاتر می‌برد. زمانی که این الکترون‌ها به حالت استراحت برمی‌گردند، به سطح پایین‌تری از انرژی می‌رسند و از خود نور ساطع می‌کنند. برای قابل تشخیص شدن این نور، فلورسانس ساطع شده از نمونه، از یک نور تحریکی روشن‌تر در فیلتر دوم جدا می‌شود. این کار به این دلیل انجام می‌شود که نور ساطع شده دارای طول موج بلندتر و انرژی کمتری نسبت به نور روشن کننده سطح است.
آماده سازی نمونه
برای تصویر برداری با این میکروسکوپ، نمونه باید فلورسانس باشد. روش های مختلفی برای فلورسانس کردن نمونه وجود دارد. لیبلینگ نمونه ها با رنگ های فلورسانس و یا بیان پروتئین های فلورسانس در نمونه های بیولوژیک مرسوم ترین این روش ها هستند. با رنگ آمیزی انتخابی پروتئین ها می توان به مطالعه فرآیندهای سلولی پرداخت. این رنگ ها می توانند به بخش های مشخصی از مولکول های درون سلول بچسبند. از مشهورترین رنگ ها می توان به رنگ های اسیدهای نوکلئیک مانند DAPI و هوخست اشاره کرد. این رنگ ها به دلیل اتصال به DNA برای تصویربرداری از هسته سلول ها به کار می روند. پپتیدها، مواد توکسین و داروها دیگر رنگ هایی هستند که با مواد فلورسانت مشتق سازی شده اند. ایمونوفلورسانت روش پرکاربرد دیگری است که در آن از آنتی بادی ها برای اتصال بسیار انتخابی یه آنتی ژن ها برای لیبل زنی پروتئین ها و دیگر مولکول ها در سلول استفاده می شود. نمونه ای تصاویر گرفته شده با این میکروسکوپ در شکل زیر نشان داده شده است.
میکروسکوپ اپی فلورسانس
امروزه بیشتر میکروسکوپ‌های فلورسانس مورد استفاده در زیست‌شناسی، میکروسکوپ‌های اپی‌فلورسانس هستند، به این معنی که هم تحریک و هم مشاهده فلورسانس در قسمت بالای نمونه اتفاق می‌افتد. بیشتر آنها از لامپ تخلیه قوس زنون یا مرکوری برای منبع نور قوی‌تر استفاده می‌کنند. در میکروسکوپ Epi-fluorescence تحریک نمونه با فلورسانس و تشخیص نور فلورسنت ساطع شده با طی کردن همان مسیر نور یعنی از طریق عدسی شیئی انجام می شود. چنین میکروسکوپ هایی به ویژه برای مشاهده نمونه های زنده استفاده می شوند. برای به دست آوردن وضوح بیشتر تصاویر، دیافراگم عددی لنز شیئی افزایش یافته است.Epi-fluorescence نسبت سیگنال به نویز بالایی را تولید می کند زیرا مقداری از نور منعکس شده با نور ساطع شده از نمونه ترکیب می شود. به همین دلیل از پرتو شکاف دهنده دو رنگ استفاده می شود. این پرتو شکافنده به عنوان یک فیلتر طول موج انتخابی عمل می کند و فقط نور فلورسانس ساطع شده را به چشمی یا عدسی چشمی منتقل می کند.
توسعه و پیشرفت میکروسکوپ های فلورسانس
میکروسکوپ‌های فلوئورسانس دارای مشکلاتی نظیر پراش نور، عدم جمع‌آوری تمام نور فلورسانس گسیل‌شده توسط عدسی شیئی میکروسکوپ و وجود نور اضافی پس زمینه که باعث تاری عکس‌های نهایی می‌باشند. برای برطرف کردن مشکلات میکروسکوپ‌های فلورسانس، روش‌های گوناگونی برای کاهش نور زمینه و جمع‌آوری بهتر نور توسط عدسی شیئی ابداع شده است که می‌توان آنها را به دو دسته تقسیم کرد:
۱- میکروسکوپ‌های میدان وسیع (wide-field microscope) مانند میکروسکوپ بازتاب کلی(TIRF)
۲- میکروسکوپ‌های روبشی نقطه‌ای (point scanning microscope) مانند میکروسکوپ هم کانونی (confocal microscope)، میکروسکوپ دوفوتونی (multi-photon microscope) و میکروسکوپ چهار پی (4pi microscope)
میکروسکوپ‌های میدان وسیع
در میکروسکوپ‌های میدان وسیع نور لیزر به صورت همزمان به تمام نمونه تابانده می‌شود و در نتیجه احتمال برانگیخته شدن ملکول‌های فلوئورسانس در سرتاسر نمونه وجود دارد. به این علت، جمع آوری داده در این میکروسکوپ‌ها با سرعت زیاد انجام می‌شود. اما در معرض قرار دادن تمام نمونه در مقابل نور لیزر می‌تواند باعث برانگیخته شدن ملکول‌های فلوئورسانسی شود که به قسمت‌های ناخواسته نمونه (معمولا خارج از کانون اپتیکی) متصل شده‌اند که منتج به مقدار زیادی نور اضافی زمینه می‌شود. برای حل این مشکل از میکروسکوپ بازتاب کلی استفاده می‌شود. در این میکروسکوپ، نمونه روی یک لایه نازک شفاف قرار می‌گیرد و نور لیزر با زاویه‌ای بزرگتر از زاویه‌ی حد به آن تابانده می‌شود. در نتیجه، نور لیزر تماما بازتاب می‌شود. ولی مقدار کمی از نور به صورت امواج میرا (evanescent waves) به طرف دیگر لایه نازک نفوذ کرده و باعث برانگیخته شدن ملکول‌های فلوئورسانسی که نزدیک سطح لایه هستند می‌شود. به این ترتیب، نور اضافی زمینه که ناشی از ملکول‌های فلوئورسانسی که در فواصل زیاد از لایه شفاف هستند به شدت کاهش می‌یابد. این میکروسکوپ برای مطالعه غشای سلولی بسیار مناسب می‌باشد.
میکروسکوپ‌های روبشی نقطه‌ای
در میکروسکوپ‌های روبشی نقطه‌ای، به جای تاباندن نور لیزر به کل نمونه، نور لیزر در یک نقطه از نمونه (x,y,z) متمرکز می‌شود. به این ترتیب تنها ملکول‌های داخل نقطه کانونی امکان برانگیخته شدن دارند و نور زمینه به نسبت میکروسکوپ‌های میدان وسیع کاهش می‌یابد. اما برای تصویر برداری از کل نمونه، هر نقطه از آن باید به ترتیب نوردهی شود (optical sectioning) که مدت زمان طولانی‌تری نسبت به میکروسکوپ میدان وسیع نیاز دارد.
اما هنوز به علت اندازه متناهی نقطه کانونی لیزر (معمولا در حدود چند صد نانومتر) امکان برانگیخته شدن تعداد زیادی ملکول فلورسانس در اطراف نقطه کانونی لیزر وجود دارد. در نتیجه این ملکول‌ها مقدار زیادی نور اضافه زمینه ساطع می‌کنند که باعث کاهش وضوح تصاویر حاصل می‌شود. برای کاهش این نور زمینه، در میکروسکوپ هم‌کانونی از یک روزنه ریز در مسیر نور فلوئورسانس قبل از دوربین آشکار ساز تعبیه شده است که تنها به نور ناشی از ملکول‌های نزدیک به مرکز کانونی لیزر اجاز عبور می‌دهد. در نتیجه نور اضافی ساطع شده توسط ملکول‌های دورتر از مرکز کانونی فیلتر شده و تصاویر با وضوح بالاتری حاصل می‌شود. وضوح تصاویر نهایی رابطه مستقیم با اندازه روزنه دارد و در صورت استفاده از روزنه‌های بسیار ریز وضوح این تصاویر می‌تواند تا دو برابر افزایش یابد.
در میکروسکوپ دو فوتون، به جای استفاده از یک لیزر، از دو لیزر با طول موج دو برابر برای برانگیخته کردن ملکول‌های فلوئورسانس استفاده می‌شود. در این حالت ملکول‌ها دو فوتون به صورت همزمان جذب کرده و برانگیخته می‌شوند. مزیت استفاده از دو لیزر همزمان در این هست که در اثر برهمنهی و تداخل نور دو لیزر در نقطه کانونی، اندازه نقطه کانونی کاهش یافته و در نتیجه نور زمینه نیز کاهش می‌یابد.
با وجود تمام این پیشرفت‌ها، قدرت تفکیک میکروسکوپ‌های فلورسانس هنوز محدود به تقریبا ۱۰۰ نانومتر هست. اما در سال ۲۰۱۴، جایزه نوبل شیمی به اریک بتزیگ، ویلیام اسکو مورنر و استفان هل برای ابداع میکروسکوپ فلورسانس با وضوح خارق‌العاده (super-resolution fluorescence microscopy) اهدا شد. این میکروسکوپ نوری قادر به تصویربرداری در ابعاد نانو می‌باشد.
زهرا سروآزاد
